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在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素PE标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

7-AAD(7-amino-actinomycin D)是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD -为正常活力细胞。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V-PE联合使用。

1. Annexin V-PE组份建议按需分装冻存于-20℃，避光保存及使用，避免反复冻融。
   
2. Binding Buffer组份不用时可放置于4℃保存，需要避光。
   
3. 7-AAD为潜在致癌物，操作时请采取防护措施，穿防护服、戴手套等。
   
4. 微量试剂取用前请离心集液。
   
5. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。
   
6. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮刀会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
   
7. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
   
8. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

1. 细胞收集
   
   1. 悬浮细胞：2000rpm，离心5min收集；
      
   2. 贴壁细胞：贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集。
      注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性。
2. 用PBS洗涤细胞二次(2000rpm，离心5min)收集1～5×10⁵细胞；
   
3. 加入100μL的Binding Buffer轻轻吹匀成单细胞悬液；
   
4. 加入1μL Annexin V-PE和5μL 7-AAD染液，轻轻吹匀；
   
5. 室温、避光、反应5～10min；
   
6. 反应后再加入400μL的Binding Buffer混匀；
   
7. 请在1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测；
   
8. 流式细胞仪分析
   
   1. 用流式细胞仪检测，PE激发波长Ex=488nm；发射波长Em=578nm，橙红色荧光，建议使用FL2通道检测；7-AAD激发波长Ex=546nm;发射波长Em=647nm，红色荧光，建议使用FL3通道检测。
      
   2. 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。